Orologi epigenetici: cosa sono, come funzionano e cosa misurano

Gli orologi epigenetici sono modelli quantitativi che utilizzano soprattutto pattern di metilazione del DNA per stimare caratteristiche associate all’età e all’invecchiamento. Analizzano specifici siti del DNA, chiamati CpG, e combinano queste informazioni attraverso modelli statistici o di machine learning.

Non esiste però un unico orologio epigenetico e non tutti i modelli misurano la stessa cosa. Alcuni sono stati sviluppati principalmente per stimare l’età cronologica, altri per intercettare segnali associati a salute e mortalità, altri ancora per stimare il ritmo con cui alcuni parametri fisiologici cambiano nel tempo.

Per questo motivo età biologica, età epigenetica, accelerazione dell’età epigenetica e pace of aging sono concetti correlati, ma non equivalenti. Un risultato ottenuto da un orologio epigenetico non rappresenta automaticamente la “vera età biologica” di una persona.

Che cosa sono gli orologi epigenetici

Un orologio epigenetico è un modello matematico che utilizza caratteristiche epigenetiche per produrre una stima quantitativa associata all’età o all’invecchiamento. Nella maggior parte degli orologi sviluppati nell’uomo, le informazioni utilizzate derivano dalla metilazione del DNA: per questo si parla anche di DNA methylation clocks o DNAm clocks.

Il principio nasce dall’osservazione che, in specifiche regioni del DNA, i livelli di metilazione mostrano variazioni associate all’età sufficientemente regolari da poter essere utilizzate per costruire modelli predittivi.

Il termine “orologio” può però essere fuorviante se interpretato in senso letterale. Questi modelli non osservano direttamente un unico processo biologico che scandisce l’invecchiamento. Elaborano invece una serie di segnali molecolari e li trasformano in una stima sulla base del target utilizzato durante lo sviluppo del modello.

È quindi più corretto considerarli una particolare famiglia di biomarcatori e predittori quantitativi studiati nella biologia dell’invecchiamento.

Come funzionano gli orologi epigenetici

Metilazione del DNA e siti CpG

La metilazione del DNA è uno dei principali meccanismi studiati dall’epigenetica. Consiste, in termini semplificati, nell’aggiunta di gruppi metile al DNA, frequentemente in corrispondenza di dinucleotidi citosina-guanina chiamati siti CpG.

Con l’avanzare dell’età, alcuni siti CpG tendono a modificare il proprio livello di metilazione secondo pattern relativamente regolari. Altri risentono maggiormente del tipo cellulare, della genetica, delle esposizioni ambientali, dello stato di salute e di numerosi altri fattori.

Gli orologi epigenetici non analizzano quindi “tutta l’epigenetica”. Selezionano un insieme di siti CpG che risultano informativi rispetto al particolare obiettivo per cui il modello viene costruito.

Come viene costruito e validato un clock

Per sviluppare un orologio epigenetico si analizzano grandi quantità di dati di metilazione e si utilizzano metodi statistici o di machine learning per identificare le caratteristiche che permettono di stimare un determinato target.

Il punto essenziale è proprio il target di training.

Se un modello viene addestrato per prevedere l’età anagrafica, selezionerà pattern utili a questo scopo. Se viene costruito utilizzando mortalità, fenotipi clinici o variazioni fisiologiche longitudinali, il significato dell’output sarà diverso.

La validazione richiede poi di verificare le prestazioni del modello in dati e popolazioni differenti da quelli utilizzati per costruirlo. Popolazione, età, tessuto biologico e piattaforma analitica possono influenzarne le prestazioni.

Non tutti gli orologi epigenetici misurano la stessa cosa

La storia degli orologi epigenetici mostra un progressivo cambiamento degli obiettivi. Una classificazione frequente distingue clock di prima, seconda e terza generazione, ma questa terminologia non è completamente standardizzata.

Per comprenderne le differenze è più utile chiedersi che cosa sia stato utilizzato come target per costruire ciascun modello.

Orologi dell’età cronologica: Hannum e Horvath

Nel 2013 furono pubblicati due modelli destinati a diventare fondamentali nello sviluppo del settore.

Il clock di Hannum fu sviluppato principalmente utilizzando campioni di sangue. Nello stesso anno Steve Horvath pubblicò un modello basato su 353 siti CpG, sviluppato utilizzando migliaia di campioni provenienti da numerosi tessuti e tipi cellulari.

L’obiettivo principale di questi primi modelli era stimare con precisione l’età cronologica a partire dai pattern di metilazione.

La loro capacità di ricostruire l’età anagrafica ha rappresentato un risultato scientifico importante, ma un modello molto accurato nel predire l’età cronologica non è necessariamente il modello più informativo sull’invecchiamento biologico, sulla salute o sulla mortalità.

PhenoAge, GrimAge e i modelli orientati agli outcome

Una generazione successiva di modelli ha modificato la domanda di partenza.

DNAm PhenoAge, pubblicato nel 2018, è stato sviluppato attraverso un processo che integra età cronologica e biomarcatori clinici associati alla mortalità. L’obiettivo era catturare informazioni relative alla variabilità dello stato di salute che i primi clock cronologici potevano non rappresentare.

GrimAge, pubblicato nel 2019, utilizza invece surrogate epigenetiche di proteine plasmatiche e dell’esposizione cumulativa al fumo all’interno di un modello orientato alla previsione del tempo alla morte. GrimAge2 ha successivamente ampliato questo approccio introducendo ulteriori segnali.

Questi modelli mostrano associazioni con mortalità e diversi outcome legati all’invecchiamento, ma ciò non significa che misurino direttamente la durata della vita futura di una persona.

DunedinPACE e il pace of aging

Un’impostazione ancora diversa caratterizza DunedinPoAm e il successivo DunedinPACE.

Questi modelli derivano dal Dunedin Study, una coorte seguita longitudinalmente nella quale è stato possibile osservare nel tempo il cambiamento di molteplici indicatori fisiologici.

DunedinPACE utilizza la metilazione del DNA per stimare questo costrutto longitudinale. Il risultato viene interpretato come una stima del pace of aging, cioè del ritmo del cambiamento fisiologico rispetto al tempo cronologico rappresentato dal modello.

Non è tuttavia una misurazione diretta e istantanea di tutti i processi dell’invecchiamento. È una stima modellistica costruita per approssimare un fenomeno osservato longitudinalmente.

Età biologica, età epigenetica e accelerazione dell’età: quali differenze

La distinzione tra questi concetti è essenziale per interpretare correttamente gli orologi epigenetici.

L’età biologica è un concetto più ampio che cerca di descrivere lo stato biologico e funzionale di una persona rispetto a ciò che sarebbe atteso considerando soltanto l’età cronologica. Non esiste oggi un unico gold standard universalmente accettato per misurarla.

L’età epigenetica è invece l’output prodotto da uno specifico modello basato sulla metilazione del DNA, generalmente espresso in unità di età. Non rappresenta una proprietà unica e immutabile dell’individuo: il valore può cambiare in funzione del clock utilizzato, del tessuto analizzato, della piattaforma e delle procedure di elaborazione dei dati.

L’accelerazione dell’età epigenetica, o epigenetic age acceleration, descrive una deviazione rispetto all’età attesa. Può essere calcolata come semplice differenza tra età epigenetica ed età cronologica oppure attraverso metodi statistici più complessi, come il residuo di una regressione. Queste misure non sono necessariamente equivalenti.

Il pace of aging rappresenta invece un altro costrutto: riguarda la velocità stimata del cambiamento biologico nel tempo.

Una persona può quindi presentare un valore superiore all’atteso secondo un determinato clock di età epigenetica e contemporaneamente un risultato differente con un modello di pace of aging. Non si tratta necessariamente di una contraddizione: i modelli possono essere stati progettati per misurare fenomeni diversi.

Che cosa possono indicare gli orologi epigenetici

Gli orologi epigenetici misurano pattern di metilazione del DNA e li trasformano, attraverso modelli addestrati su target specifici, in stime quantitative associate all’età cronologica o a particolari dimensioni dell’invecchiamento e del rischio.

Dire semplicemente che “misurano l’età biologica” è quindi una semplificazione. Alcuni modelli possono essere utilizzati come indicatori di aspetti dell’invecchiamento biologico, ma nessun singolo clock rappresenta l’intero processo di aging.

Mortalità e morbilità

Alcuni modelli, in particolare quelli sviluppati utilizzando outcome clinici o di mortalità, mostrano associazioni con il rischio di morte e con diverse condizioni correlate all’età.

GrimAge e GrimAge2 sono tra gli esempi più studiati in questo ambito. La loro capacità prognostica riguarda tuttavia associazioni osservate nelle popolazioni studiate.

Un’associazione con la mortalità non significa che il clock possa stabilire quanto vivrà un singolo individuo, né che il valore ottenuto corrisponda direttamente ad anni di vita persi o guadagnati.

Fragilità, funzione e salute nel tempo

Diversi studi hanno analizzato le relazioni tra accelerazione dell’età epigenetica, fragilità, funzione fisica, morbilità, cognizione e altri outcome.

Le associazioni variano considerevolmente in funzione del clock, della popolazione e dell’outcome considerato. In diversi studi, alcuni modelli orientati agli outcome hanno mostrato associazioni più consistenti con determinati indicatori di salute rispetto ai primi clock costruiti principalmente per stimare l’età cronologica.

Anche healthspan e durata della vita restano però concetti distinti dall’output di un clock. Un biomarcatore associato a mortalità o funzione può fornire informazioni utili nella ricerca sulla salute nel tempo senza misurare direttamente quanti anni di vita sana rimangano a una persona.

Quanto sono affidabili gli orologi epigenetici

L’affidabilità di un orologio epigenetico non può essere riassunta in una risposta unica. Occorre distinguere almeno validità, capacità predittiva, riproducibilità tecnica e stabilità biologica.

Validità e capacità predittiva

Per i clock sviluppati per stimare l’età cronologica, la capacità di ricostruire l’età è ben documentata quando il modello viene applicato nei contesti appropriati.

Valutare un clock come misura dell’invecchiamento biologico è più complesso perché non esiste un gold standard universale di “età biologica” con cui confrontarlo.

Per i modelli orientati agli outcome è possibile invece valutare quanto l’output sia associato, per esempio, a mortalità, fragilità o morbilità. Anche in questo caso è importante stabilire quale informazione aggiunga rispetto a età cronologica, anamnesi, fattori di rischio e biomarcatori clinici tradizionali.

Reliability e riproducibilità

La reliability riguarda la capacità di ottenere risultati sufficientemente stabili quando la misurazione viene ripetuta nelle condizioni previste.

Studi su replicati tecnici hanno mostrato che alcuni clock possono essere sensibili al rumore analitico. Approcci basati sulle componenti principali sono stati sviluppati proprio per migliorare la riproducibilità delle misure epigenetiche nel monitoraggio longitudinale.

La ricerca più recente distingue inoltre la riproducibilità tecnica dalla stabilità biologica. Un test può essere analiticamente riproducibile e mostrare comunque variazioni biologiche a breve termine.

Questa distinzione diventa particolarmente importante quando si confrontano due misurazioni effettuate sulla stessa persona.

Tessuto, piattaforma e variabilità tecnica

Il risultato dipende anche dal materiale biologico analizzato.

Sangue, saliva, cellule buccali e altri tessuti non sono necessariamente intercambiabili. Un clock sviluppato e validato nel sangue può comportarsi diversamente quando viene applicato a un altro tessuto.

Anche le piattaforme utilizzate per analizzare la metilazione, le procedure di laboratorio, la normalizzazione dei dati, il preprocessing e la gestione dei siti mancanti possono introdurre variabilità.

Per questo motivo non è scientificamente rigoroso parlare di una singola “età epigenetica dell’individuo” senza specificare almeno quale modello e quale tessuto siano stati utilizzati.

Come interpretare un risultato individuale

Se una persona di 52 anni ottiene da un test un’età epigenetica di 48 anni, non è possibile concludere automaticamente che sia biologicamente più giovane di quattro anni.

Il risultato indica che, secondo quello specifico modello e nelle condizioni in cui è stata effettuata l’analisi, il pattern di metilazione ha prodotto una stima inferiore rispetto al riferimento considerato.

Non significa necessariamente che:

• l’intero organismo sia quattro anni più giovane;
• gli organi abbiano un’età biologica inferiore di quattro anni;
• la persona vivrà quattro anni più a lungo;
• il suo invecchiamento proceda quattro anni più lentamente;
• esista una condizione clinica diagnosticabile sulla base di quel valore.

Al momento non esistono soglie cliniche universalmente condivise che permettano di classificare una persona come “biologicamente giovane” o “biologicamente vecchia” sulla base degli orologi epigenetici nel loro complesso.

Mancano inoltre intervalli di riferimento clinici universalmente applicabili e una minimal clinically important difference generale che consenta di stabilire quando una variazione individuale di pochi anni sia clinicamente significativa.

Lo stesso problema riguarda il confronto nel tempo. Se un test passa, per esempio, da 52 a 48 anni epigenetici, prima di attribuire la differenza a un cambiamento biologico occorre considerare errore tecnico, variabilità biologica, tessuto, laboratorio, piattaforma, preprocessing e possibile regressione verso la media.

Gli orologi epigenetici possono misurare gli effetti di un intervento?

Gli orologi epigenetici vengono studiati anche per verificare se siano sensibili a interventi sullo stile di vita o ad altre strategie investigate nella ricerca sull’invecchiamento.

Esistono però diversi livelli di evidenza:

1. un clock può essere associato a uno stile di vita in uno studio osservazionale;
2. può cambiare spontaneamente nel tempo;
3. può modificarsi in risposta a un intervento;
4. la sua variazione può essere associata a un beneficio clinico;
5. può eventualmente essere validato come endpoint surrogato di uno specifico outcome.

Questi passaggi non sono equivalenti.

Che cosa mostrano gli studi

Un esempio importante proviene dal trial randomizzato CALERIE, nel quale adulti senza obesità sono stati assegnati a restrizione calorica o alimentazione ad libitum per due anni.

Nelle analisi delle misure epigenetiche, la restrizione calorica è stata associata a un piccolo rallentamento di DunedinPACE, mentre non sono emerse variazioni significative per alcune altre misure, tra cui PhenoAge e GrimAge.

Studi su attività fisica, nutrizione e interventi multimodali hanno prodotto risultati di interesse, ma anche effetti eterogenei o discordanti tra clock differenti.

La discordanza non implica necessariamente che uno dei modelli sia errato: modelli costruiti su target differenti possono rispondere diversamente allo stesso intervento.

Perché una variazione del clock non dimostra un ringiovanimento

La capacità di un biomarcatore di cambiare in risposta a un intervento viene definita responsiveness.

Dimostrare che un clock è responsive non significa però dimostrare che l’organismo sia “ringiovanito” o che l’intervento abbia rallentato il processo complessivo di invecchiamento.

Per arrivare a una conclusione clinicamente più forte sarebbe necessario dimostrare che la variazione del biomarcatore rappresenti in modo affidabile una variazione di outcome rilevanti per la salute.

È quindi più corretto parlare di modificazione di uno specifico biomarcatore epigenetico piuttosto che di inversione dell’età biologica.

Dalla ricerca alla clinica: quale utilità hanno oggi?

Gli orologi epigenetici sono strumenti importanti nella ricerca sull’invecchiamento. Il loro possibile impiego nella medicina della longevità e nella gestione clinica del singolo individuo richiede però livelli di validazione ulteriori.

È utile distinguere tre concetti:

• validità analitica: il test misura in modo sufficientemente accurato e riproducibile ciò che dichiara di misurare a livello analitico;
• validità clinica: il risultato è associato in modo sufficientemente validato a uno stato o a un outcome clinico nello specifico contesto d’uso;
• utilità clinica: utilizzare il risultato migliora concretamente una decisione o un outcome rispetto alla pratica standard.

Per gli orologi epigenetici esistono livelli differenti di validità analitica e prognostica, ma l’utilità clinica individuale non è attualmente dimostrata in modo generale per questa classe di strumenti.

Orologi epigenetici e geroscienza

Nella geroscienza, disporre di biomarcatori capaci di rilevare cambiamenti in tempi molto più brevi rispetto allo sviluppo di malattie, disabilità o mortalità sarebbe estremamente utile.

Gli orologi epigenetici vengono quindi studiati come possibili strumenti per la stratificazione delle popolazioni, l’analisi delle esposizioni e la valutazione della risposta biologica agli interventi.

Resta però aperto il problema degli endpoint surrogati. Un biomarcatore non diventa un endpoint surrogato soltanto perché è associato a un outcome, lo predice o cambia durante un trattamento.

La validazione richiede di dimostrare, nello specifico contesto d’uso, che il cambiamento indotto sul biomarcatore rappresenti in modo affidabile il cambiamento dell’outcome clinico rilevante.

Gli attuali orologi epigenetici possono quindi essere utilizzati come biomarcatori o endpoint di ricerca in diversi contesti, ma non possono essere considerati nel loro complesso endpoint surrogati validati dell’invecchiamento.

Test commerciali dell’età biologica

La disponibilità di test commerciali ha reso familiare l’idea di ottenere da un campione biologico un numero definito come “età biologica”.

È però necessario distinguere la validazione scientifica di un algoritmo dalla validazione del prodotto commerciale che lo utilizza.

Un test completo comprende infatti molti altri elementi: modalità di raccolta e conservazione del campione, laboratorio, piattaforma analitica, preprocessing, eventuale imputazione dei dati, implementazione dell’algoritmo, popolazione di riferimento e modalità con cui il risultato viene interpretato.

L’impiego di un algoritmo pubblicato nella letteratura scientifica non rende quindi automaticamente clinicamente validato il test commerciale che lo incorpora.

In particolare, formulazioni come “scopri la tua vera età biologica”, “misura quanto velocemente stai invecchiando” o “verifica quanti anni hai ringiovanito” possono attribuire al risultato un significato superiore a quello attualmente sostenuto dalle evidenze.

Orologi epigenetici e longevità estrema

Lo studio dei centenari e della longevità estrema offre un contesto particolare per analizzare la relazione tra età cronologica ed età epigenetica.

Studi condotti su semi-supercentenari italiani e sui loro discendenti hanno osservato, con specifici modelli, valori di età epigenetica inferiori rispetto a quelli attesi. Altre ricerche su popolazioni di eccezionale longevità hanno individuato pattern epigenetici peculiari.

Questi risultati sono compatibili con l’esistenza di caratteristiche epigenetiche associate alla longevità estrema, ma non dimostrano che una minore età epigenetica sia la causa della longevità.

Negli individui di età eccezionalmente avanzata assumono inoltre particolare importanza la calibrazione del modello, il survivor bias, il tessuto analizzato e la rappresentatività delle popolazioni utilizzate per sviluppare il clock.

Sono stati sviluppati anche orologi specificamente destinati a migliorare la stima dell’età cronologica dei centenari e supercentenari. Il loro obiettivo è però diverso dalla misurazione della qualità dell’invecchiamento o della durata futura della vita.

Le nuove frontiere della ricerca

La ricerca sugli orologi epigenetici si sta progressivamente allontanando dall’idea di ottenere un singolo numero universale capace di riassumere l’invecchiamento.

Tra le direzioni studiate vi sono:

• principal-component clocks, sviluppati per aumentare la reliability delle misure;
• clock specifici per tessuti, progettati per contesti biologici particolari;
• modelli multi-sistema, che cercano di rappresentare l’eterogeneità dell’invecchiamento tra differenti sistemi fisiologici;
• clock causalmente informati, che tentano di distinguere segnali potenzialmente coinvolti nei processi biologici da semplici correlati predittivi;
• single-cell clocks, ancora in una fase emergente;
• modelli multi-omici, che integrano metilazione, proteomica, metabolomica, trascrittomica, dati clinici o altre informazioni biologiche.

Questi sviluppi riflettono un problema fondamentale: l’invecchiamento è un fenomeno multidimensionale e difficilmente può essere rappresentato in modo completo da un singolo biomarcatore.

La crescente capacità predittiva dei modelli non risolve inoltre automaticamente le questioni della causalità. I siti CpG utili a prevedere un outcome non sono necessariamente siti causalmente responsabili dei processi biologici dell’invecchiamento.

Limiti e questioni ancora aperte

Gli orologi epigenetici hanno modificato profondamente il modo in cui la ricerca può quantificare alcuni fenomeni associati all’invecchiamento. Rimangono tuttavia importanti questioni aperte.

Tra le principali:

• non esiste un gold standard universalmente accettato dell’invecchiamento biologico;
• clock differenti possono rappresentare dimensioni biologiche differenti;
• non sono disponibili soglie cliniche universali per interpretare il risultato individuale;
• la comparabilità tra tessuti, piattaforme e laboratori rimane un problema rilevante;
• la generalizzabilità può diminuire nelle popolazioni poco rappresentate nei dataset di sviluppo;
• la stabilità biologica e la riproducibilità tecnica non sono la stessa cosa;
• le CpG predittive non sono necessariamente causalmente coinvolte nell’invecchiamento;
• la risposta di un clock a un intervento non dimostra da sola un beneficio clinico;
• l’utilità clinica per le decisioni sul singolo individuo resta da dimostrare in modo adeguato;
• gli attuali clock non costituiscono, come classe, endpoint surrogati validati dell’invecchiamento.

Il valore scientifico degli orologi epigenetici non dipende quindi dalla possibilità di ridurre l’invecchiamento a un singolo numero. Il loro contributo più importante consiste nell’aver reso quantitativamente studiabili diverse dimensioni molecolari e fisiologiche associate al tempo biologico, agli outcome di salute e al ritmo del cambiamento.

Comprendere che cosa misura ciascun modello, come è stato costruito e quali sono i suoi limiti è essenziale per utilizzare queste informazioni senza trasformare un biomarcatore di ricerca in una diagnosi o in una previsione individuale che i dati non consentono ancora di formulare.

Domande frequenti sugli orologi epigenetici

Alcuni termini utilizzati nella ricerca sugli orologi epigenetici vengono spesso sovrapposti. Queste risposte sintetizzano le distinzioni più importanti.

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